Chimie

Méthodes de génie génétique

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Effectuer une électrophorèse sur gel d'agarose

Pour la séparation de fragments d'ADN d'une taille de 0,8 à 12 kb, des gels d'agarose à 0,8% sont généralement utilisés. Comme décrit à la page Préparation d'une solution d'agarose, l'agarose est pesé dans un erlenmeyer, constitué de tampon d'électrophorèse, bouilli et porté à environ 50 °C refroidi avant que la solution puisse être versée dans le plateau de gel préparé. Une fois le gel durci, le peigne est retiré.

Préparer le gel

Avant l'électrophorèse sur gel, les deux côtés de la chambre d'électrophorèse sont remplis du tampon d'électrophorèse approprié (tampon TBE ou TAE) avant que le gel d'agarose fini puisse être utilisé dans le même tampon et que le peigne d'échantillon puisse être retiré. Le tampon doit remplir complètement les poches de gel et recouvrir juste le gel. Attention : Le gel doit être correctement positionné dans la chambre pour que les échantillons migrent à travers le gel jusqu'à l'anode !

Préparation des échantillons

Avant l'électrophorèse sur gel, l'ADN est mélangé avec du tampon courant dans un rapport d'environ 5 : 1. Ce tampon contient du glycérol et augmente la densité de la solution d'ADN afin que l'échantillon s'enfonce dans la poche de gel et ne soit pas lavé. De plus, le tampon de chargement contient un marqueur de couleur, généralement du bleu de bromophénol et/ou du xylène cyanol, avec lequel le déroulement de l'électrophorèse peut être surveillé. Le bleu de bromophénol migre dans le gel d'agarose parallèlement à l'ADN avec une taille d'environ 450 pb, de sorte que l'électrophorèse sur gel peut être terminée à temps avant que les petits fragments du gel ne passent dans le tampon de migration. Afin de pouvoir déterminer ultérieurement la taille des fragments d'ADN, un standard de taille d'ADN tel que, par exemple, est utilisé dIII ouDe derrièreIII /ÉcoADN digéré par RI utilisé.

La course au gel

Dès que tous les échantillons ont été pipetés dans les poches de gel, une tension peut être appliquée, qui est généralement de 5 V/cm devrait être. Avec de grands volumes d'échantillon (20 µl), la netteté des bandes peut être augmentée si initialement seulement une tension de 1 V/cm est appliqué jusqu'à ce que les échantillons aient migré de la poche de gel dans le gel. Le gel ne doit pas chauffer ni même fondre lors de l'électrophorèse ; dans ce cas, la tension appliquée est trop élevée ou le tampon de fonctionnement doit être renouvelé.

Après la fin du gel run, le gel est coloré avec du bromure d'éthidium afin que l'ADN puisse ensuite être rendu visible sous lumière UV à 254 nm. Les gels peuvent désormais être photographiés et évalués sous forme de copie papier ou sous forme numérique.

Noter
Une concentration élevée en sel dans l'échantillon d'ADN entrave la migration de l'ADN dans le gel et peut conduire à un front de coulée irrégulier, ce qui rend difficile l'évaluation ultérieure du gel. Si l'ADN contient encore des résidus d'éthanol, l'échantillon ne peut pas être pipeté dans la poche de gel et est immédiatement rincé à nouveau.


Vidéo: Le génie génétique pour les SVT et préparation médecine (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Besyrwan

    Est-elle sérieuse ?

  2. Dur

    Tout est juste superbe.

  3. Odwolf

    Je pense que des erreurs sont commises. Je suis capable de le prouver. Écrivez-moi dans PM, parlez.

  4. Kakasa

    Je crois que tu as eu tort. Écrivez-moi dans PM, cela vous parle.

  5. Grimm

    Merci beaucoup pour l'information, maintenant je sais.

  6. Woden

    Oui tu as du talent :)



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