Chimie

Lab 3 : Hybridation d'ADN

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La température d'hybridation

L'un des facteurs les plus importants dans l'hybridation est de choisir la bonne température. Si la température est trop élevée, même les séquences homologues peuvent ne pas se lier à la cible.

La température optimale d'une hybridation doit être calculée sur la base de la séquence d'ADN - un ADN avec une teneur élevée en GC, par exemple, a une température de fusion différente d'un ADN de même longueur qui se compose uniquement de paires AT. Cela est dû au fait que pour faire fondre une paire GC, trois ponts hydrogène au lieu de deux (pour une paire AT) doivent être brisés - et cela nécessite plus d'énergie. Pour la même raison, la longueur de l'ADN est également importante - plus il y a de nucléotides impliqués dans la liaison, plus la température de fusion de cet ADN est élevée. Et last but not least, des facteurs tels que le Na+-La concentration (plus élevée, plus l'hybride sera stable) ou le solvant jouent également un rôle. Si l'approche contient du formamide apolaire (comme lors de la manipulation d'ARN), le double brin est déstabilisé, de sorte que la température d'hybridation doit être abaissée. Toutes les personnes décalagec'est-à-dire que tout nucléotide non apparié abaisse également la température d'hybridation optimale.

La formule suivante peut être utilisée pour estimer la température en tenant compte de ces paramètres :

Tm = 81,5 °C + 0,41 x (% GC) + 16,6 log [Na+Concentration] - (820 : L) - 0,61 x (% formamide) - 1,4 (% décalage)

(Tm = température de fusion, L = longueur de la sonde. La température d'hybridation devrait être d'environ 5-10 °C en dessous de la température de fusion pour les hybrides ADN/ADN, pour les hybrides ADN/ARN 5 °C.)

Noter
Plus long E. coliDes fragments d'ADN se trouvent généralement à 68 °C hybridé.

Amorces et autres petits ADN

D'autres formules d'approximation sont utilisées pour les ADN plus petits tels que les amorces. Pour estimer la température d'annelage des amorces en PCR, la règle (4 + 2) a fait ses preuves en pratique : on compte 4 pour chaque cytosine et chaque guanine, et 2. pour chaque adénine et chaque thymidine, moins cette somme 5- dix °C donne la température approximative de recuit. Si les températures de recuit des deux amorces diffèrent de manière significative, la température la plus basse doit être sélectionnée.



Commentaires:

  1. Carl

    Quelle belle phrase

  2. Mikio

    Vous n'êtes pas correcte. Je suis sûr. Écrivez en MP, nous communiquerons.

  3. Ryton

    Je m'excuse, mais vous ne pouviez pas peindre un peu plus en détail.

  4. Somerton

    Fascinant. J'aimerais également entendre l'opinion des experts à ce sujet :)

  5. Yrjo

    Félicitations, c'est juste une grande pensée.



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